服务案例

（一）内容介绍

病毒诱导的基因沉默（Virus induced gene silencing，VIGS）技术是近年来兴起的一种简单、快速的研究基因功能的方法。其作用机制为：携带靶基因片段的病毒载体在被感染的植物体中大量复制并且转移，病毒载体中的靶基因片段在RNA介导的RNA聚合酶（RNA-directed RNA polymerase，RdRP）作用下合成大量的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）。dsRNA在Dicer酶作用下产生21-25个核苷酸的短干扰RNA（short interfering RNA，siRNA）片段。然后，siRNA的反义链与RNA诱导基因沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，特异性识别细胞质中靶基因的单链mRNA，造成内源靶基因mRNA特异性降解，进而揭示目的基因的功能。

在大多数已成功的体系中，通常选择一个与光合作用有关的酶——八氢番茄红素去饱和酶（phytoene desaturase，PDS）作为报告基因。PDS基因在多数物种中仅有一个拷贝，并且具有较广的表达域；其所编码的蛋白质是类胡萝卜素合成途径中的一个关键性酶，它的沉默直接导致类胡萝卜素合成途径的阻断，使植物丧失光保护的作用，从而导致白化效应，表型变化较为直观。同时，PDS基因在植株叶片中表达，当植株被病毒载体成功侵染后，植株叶片会很快呈现出白化趋势，因此可以快速地确定病毒诱导体系是否适用于该物种的研究。

本项目共分为6个模块，模块1，前期准备；模块2，毛酸浆总RNA提取及电泳分析；模块3，毛酸浆PDS基因3’端序列的分离；模块4，毛酸浆PDS基因5’端序列的分离；模块5，毛酸浆PDS-TRV2侵染母液的制备；模块6，毛酸浆PDS-TRV2侵染转化。

主要包含以下内容：

（1）RNA提取的准备工作

（2）毛酸浆的总RNA提取

（3）琼脂糖凝胶电泳分析总RNA

（4）毛酸浆总RNA的紫外吸收分析

（5）毛酸浆PDS基因3’端序列的分离

（6）毛酸浆PDS基因5’端序列的分离

（7）毛酸浆PDS基因全长cDNA序列的分离

（8）毛酸浆PDS-TRV2载体的构建

（9）SDS碱裂解法制备载体质粒

（10）插入片段和载体质粒双酶切反应

（11）插入片段和载体质粒连接反应

（12）载体构建、阳性克隆筛选与鉴定

（13）毛酸浆PDS-TRV2载体的农杆菌转化

（14）毛酸浆PDS-TRV2侵染转化

（15）毛酸浆PDS-TRV2侵染植株表型分析

模块1，前期准备

模块2，毛酸浆总RNA提取及电泳分析

模块3，毛酸浆PDS基因3’端序列的分离

模块4，毛酸浆PDS基因5’端序列的分离

模块5，毛酸浆PDS-TRV2侵染母液的制备

模块6，毛酸浆PDS-TRV2侵染转化

（二）实验的特色和亮点

虚拟仿真实验软件综合运用分子生物学的知识与研究方法，详细介绍了VIGS技术的工作原理、基本操作、仪器参数的设置、以及在基因功能研究方面的应用。通过模拟具体操作步骤，使实验过程更加直观，通过改变仪器参数，可观察不同的实验现象和结果。