中级分析化学实验：综合与设计性实验

实验编号：U19S12800

关键词：蛋白质鉴定，液质联用

（一）内容介绍

在蛋白质组学研究中，高效液相色谱和质谱联用（HPLC-MS）技术是常用和重要的支撑工具之一。本实验拟构建一个HPLC-MS联用技术鉴定蛋白质的虚拟仿真实验平台。

本虚拟仿真实验分为4个模块。模块1，蛋白质酶解；模块2，多肽富集；模块3，多肽HPLC分离；模块4，多肽MS鉴定。

模块1，蛋白质酶解

利用胰蛋白酶对蛋白质进行酶解得到分子量较小的肽段。

（1）细胞清洗

（2）超声波粉碎细胞

（3）蛋白质清洗

（4）蛋白质风干和溶解

（5）蛋白质定量

（6）还原烷基化

（7）混合蛋白溶液的配制

（8）酶解

模块2，多肽富集

基于亲疏水相互作用，利用C18修饰的纳米材料可以选择性的吸附肽段，从而将多肽与强极性的小分子和无机盐进行分离；基于磷酸根基团与TiO₂，Ti²⁺，Zr⁴⁺等的配合亲和作用，可以利用TiO₂，Ti²⁺，Zr⁴⁺等修饰的纳米材料选择性的吸附磷酸化肽段，从而实现具有磷酸化后修饰的多肽富集。

（1）纳米材料富集磷酸化肽段

（2）脱盐

（3）肽段定量

模块3，多肽HPLC分离

利用反相色谱原理对多肽进行分离，固定相为C18修饰的色谱柱，流动相为A（水相）、B（甲醇、乙腈等有机相）的混合相，基于亲疏水相互作用对多肽进行分离。

模块4，多肽MS鉴定

利用串联质谱作为LC的检测器，可以对每个馏分中的多肽的精确分子量和特征碎片质量进行测定。综合多肽的精确分子量和碎片信息，可以实现多肽的结构分析。

（二）实验的特色和亮点

在蛋白质组学研究中，高效液相色谱和质谱联用（HPLC-MS）技术是常用和重要的支撑工具之一。但由于生物质谱仪器价格昂贵、运行成本高，使得该类实验在本科生实验教学中难以大范围展开。本实验拟构建一个HPLC-MS联用技术鉴定蛋白质的虚拟仿真实验平台。利用该平台，学生可以进行虚拟的蛋白质酶解、富集、分离和鉴定实验。实验过程中可以设置不同的实验参数达到改变实验条件的作用，并获得不同的实验结果。通过对实验结果的分析和评价，选择最优化的实验条件，达到最佳的分析结果。