中级分析化学实验：综合与设计性实验

实验编号：U19S20300

关键词：滚环扩增技术（RCA），凝胶电泳，比色法生物传感器，微量生物分子检验

所属类别：化学类

（一）内容介绍

本实验项目基于RCA反应制备封装HRP的DNA花状结构，并将其作为信号放大探针用于构建比色法生物传感器检测凝血酶。

（1）制备DNA环状模板

向离心管中加入反应物，放入基因扩增仪中反应，切割掉未成环的锁式探针和引物，并使外切酶I失活，得到了DNA环状模板。

（2）合成封装辣根过氧化物酶（HRP）的DNA花

将反应物置于基因扩增仪中，经离心和超纯水洗涤后得到封装辣根过氧化物酶的DNA花，并在4℃储存。

（3）用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表征

将配制的凝胶溶液倒入制胶板中，静置形成泳道，将制胶板放入电泳槽中，倒入电泳缓冲溶液，配制样品并加入到泳道中，室温下加170 V电压电解5分钟，对凝胶进行染色和成像。

（4）标准曲线法定量DNA花中HRP和DNA含量

为测定DNA花中DNA的含量，配制了不同浓度的λ-DNA溶液，在黑色的96孔板中加入溶液避光静置，输入激发波长，利用酶标仪测出溶液的荧光强度，三次平行实验后制作标准曲线，得出DNA含量。为测定DNA花中HRP的含量，配制了不同浓度的HRP溶液，向透明的96孔板中加入HRP溶液和考马斯亮蓝溶液，在室温下反应，输入波长，利用酶标仪测出溶液的吸光度，三次平行实验后制作标准曲线，得出HRP的含量。

（5）测定DNA花中HRP的活度

为测定DNA花中HRP的活度，利用酶标仪测出不同溶液的吸光度，得到的吸光度数值通过拟合米氏方程可以得到米氏常数和最大速率。

（6）制备固定凝血酶适体（Apt15）的磁性微球

向离心管中加入磁性微球和MES缓冲液，磁性分离后，进行洗涤，向该离心管中加入反应物，放入基因扩增仪中反应，产物洗涤三次后重新分散在PBS缓冲液中，将得到的固定凝血酶适体的磁性微球放在4 ℃冰箱中备用。

（7）合成金纳米棒

配制种子溶液和生长溶液，并将种子溶液加入到生长溶液中，将水浴加热和离心洗涤，

得到了金纳米棒。

（8）比色法检测凝血酶

对反应物进行孵育，洗涤，随后进行水浴加热，记录实验过程中的颜色变化，完成金纳米棒刻蚀反应，最后测试了这一系列溶液的吸光度。

（二）实验的特色和亮点

DNA作为一种智能纳米材料，具有稳定性高、可编程、生物相容性好等优点。目前DNA功能性材料的自组装策略主要基于碱基互补杂交和纳米颗粒模板化，往往需要复杂的序列设计和大量DNA原料的合成，并且在自组装过程中容易受到DNA间空间位阻的影响，因此开发DNA功能性材料的新型自组装技术具有重要意义。

比色法生物传感器以溶液吸光度变化为基础，当显色试剂与待测物反应后产生吸光度变化，外观表现为颜色变化，将待测物的浓度信号转换为光学信号，然后通过肉眼或者用分光光度计对溶液颜色进行观察或光谱测量，因而能够实现待测物的快速定量。